●文献解析|Nature—单细胞RNA-seq揭示年龄相关脑功能衰退机制

随着年龄增加，组织功能逐渐衰退，像是老年人的记性越来越差、学习能力下降等。但目前仍不清楚衰老过程中细胞组成发生的变化，以及这种变化如何对组织功能产生影响【1】。而对成年SVZ(室管膜下区)神经源性小生境(neurogenic niches)进行研究或能解答这些问题——SVZ小生境含有多种细胞类型【3-18】，且随年龄增加出现功能衰退。

虽然已有研究对年轻【19-26】和衰老神经干细胞谱系【27,28】进行了单细胞RNA测序分析，但尚未在单细胞分辨度上系统地检测SVZ小生境出现的变化。

体外培养第1天的神经干细胞。图源悉尼大学Ping Hu。红色是IGFBP-3，蓝色是NeuN+，绿色是β-Tubulin+ III。

来自Stanford大学Brunet实验室的研究者们通过分析3个月大(相当于人类青年)和28-/29个月大(相当于80岁人类)健康小鼠SVZ的14,685个细胞转录组，发现了可能的年龄相关脑功能衰退机制，并使用免疫荧光染色等方法，在解剖的老年人类大脑中对scRNA-seq分析的部分结果进行了确认。

这一结果发表在《Nature》上。

影响因子：43.070

通讯作者：Anne Brunet教授

通讯作者实验室：Brunet实验室

开放获取数据：RNA测序数据结果见BioProject PRJNA450425；文章使用的命令和配置文件，以及运行环境所需的各版软件。

研究者收集SVZ小生境(niches)区域的细胞并通过FACS(荧光激活细胞分选)消除碎片后，对3只年轻(3个月大)和3只年老(28-29月大)的雄性C57BL/6小鼠整个SVZ进行单细胞转录组测序(3次独立实验)。同时，研究者还采用了FACS、免疫荧光染色、免疫组化染色、bulk转录组测序等实验对单细胞转录组分析结果进行补充和验证。

年老人类和小鼠大脑中存在更多的T细胞

获得来自6只小鼠SVZ小生境14,685个细胞的转录组数据后，首先进行降维聚类分析。同时，根据获得的差异表达标志基因集和相关文献确定的标志基因以及GO数据库，对每个细胞聚群进行注释，结果发现：

❖ SVZ小生境中存在11种细胞类型，分别是astrocytes/qNSCs(星形胶质细胞和静息态神经干细胞)、aNSCs/NPCs(激活态神经干细胞和神经祖细胞)、神经母细胞、神经元、少突胶质祖细胞、少突胶质细胞、内皮细胞、“壁细胞”(如周细胞)、小胶质细胞、巨噬细胞和T细胞(图1a)；

❖ T细胞聚群大部分来源于老年小鼠，在老年小鼠的SVZ显著富集，同时aNSCs/NPCs和神经母细胞数量减少(图1b, c)；

❖ 年老小鼠SVZ中小胶质细胞、内皮细胞和少突胶质细胞的转录组发生变化(图1b, d)；

❖ 年老大脑中T细胞表达CD8+CD4- T细胞的标记基因，FACS证实了这一结果(图1j, k)；

❖ 老年大脑中T细胞也表达效应记忆细胞(低Cd62l和高Cd44)、组织驻留(Itgal和Itga4)和激活(Cd69和Xcll)的标记基因，包括细胞因子如Ifng(图1i)；

❖ 无神经退行性疾病的年老人类大脑中，在侧脑室内膜区域也浸润着CD8+ T细胞(图1l, m)。

这些结果意味着小鼠和人类年老大脑中浸润着T细胞。

图1 单细胞RNA测序揭示了年老神经源性小生境的细胞组成，且浸润的T细胞挨着神经干细胞【1】。a是全部6只小鼠SVZ小生境14,685个细胞的t-SNE降维聚类结果；b是根据样本来源对a图进行注释；c是每个细胞类型百分比随年龄增加发生的变化；d是每个细胞类型表达的每个基因随年龄增加发生的变化，有颜色的点意味着变化显著；f是CD3+ T细胞数量，g是NSCs/NPCs细胞数量(5只3-7月大年轻小鼠和4只20-24月大年老小鼠，每只小鼠侧脑室中相应细胞数量)；h是不同细胞类型中Cd3e(编码CD3)、Cd8a(编码CD8)、Cd4和Ifng基因表达水平小提琴图；i是T细胞表达了效应记忆T细胞、激活和组织驻留的标记基因，还表达INF-γ；j是年老小鼠SVZ中T细胞的FACS图；k是4只3-5月大年轻小鼠和5只24-25月大年老小鼠，对每只小鼠SVZ小生境CD8+ T细胞比例进行FACS定量的结果；l是20岁年轻和83岁年老人类大脑中(包括侧脑室)CD3和CD8(棕色)的免疫组化染色结果；m是5个20-44岁年轻和6个78-93岁年老人类(男女均有)，脑室临近区域每平方毫米的CD3+或CD8+ T细胞数量。

年老大脑中入侵的T细胞是克隆扩增的

为了描述年老大脑中T细胞的特征，研究者从每只年老小鼠(另外6只年老小鼠中的4只)的神经源性小生境和血液中提取CD8+ T细胞，并进行单细胞RNA测序，结果显示：

❖ 同一年老小鼠中，年老神经源性小生境和血液中的T细胞不同(图2a)；

❖ 神经源性小生境中T细胞高表达INF-γ和免疫检查点PD-1(图2b)。

图2 4只年老小鼠(1-4号)血液和SVZ中T细胞的t-SNE降维聚类图(左)和表达差异基因(右)【1】。

因为血脑屏障存在年龄相关的异常，因而老年大脑中T细胞可能是被动浸入【29】。此外，当T细胞识别一种抗原后会进行克隆扩增，产生的克隆具有相同TCR(T细胞受体)【30】，因而年老大脑中的大量T细胞也可能是主动识别其中抗原后产生的。

为此，研究者抽取T细胞聚群的TCR序列进行分析，发现神经源性小生境中几个T细胞亚群经过了克隆扩增，且其TCR不同于血液中T细胞克隆的TCR(图3)，表明老年大脑中T细胞不是简单的来源于被动扩散(随年龄增长，血脑屏障被破坏【29】)，而是克隆扩增产生的。为了确认这一结果，还分析了巢式PCR获取的另外两只年老小鼠(5和6号)SVZ小生境和血液中T细胞的TCR序列。

图3 SVZ小生境和血液中T细胞TCR差异(左)和克隆扩增的T细胞的比例(右)。

神经源性小生境对干扰素信号的响应

干扰素对抵御致病菌和异常的内源性核苷酸十分重要【31, 32】，也在大脑发育和成人神经源性小生境中研究了干扰素的作用【28, 33】，但仍不十分了解INF-γ充当的角色。

研究者的单细胞分析、免疫荧光染色和FACS分析均显示，与年轻对照组相比，老年小鼠SVZ小生境中aNSCs/NPCs、小胶质细胞和内皮细胞的STAT1蛋白表达明显上调(干扰素信号可上调STAT1【33】)(图4)，意味着年老神经源性小生境中多种细胞类型对INF-γ有强烈反应，当然也可能是对其他干扰素产生了响应【28】。

图4 神经源性小生境对干扰素信号的响应。a图是t-SNE降维聚类结果，颜色深浅表示的是响应INF-γ的标志基因表达水平高低。b图不同年龄、不同细胞类型响应INF-γ的标志基因表达水平高低。

来源于T细胞的INF-γ对NSCs有不利影响

为了探究T细胞对NSCs有着怎样的影响及其可能机制，研究者采用FACS分析、bulk转录组测序、活体实验、免疫荧光分析等方法，发现T细胞可通过分泌INF-γ直接抑制NSC增殖(图5)：

❖ BTS2表达增加的年老aNSCs/NPCs亚群富集表达了与INF-γ响应有关的基因，而细胞周期相关基因的转录较少(图5a, b)；

❖ 向年老小鼠中注射能与增殖状态细胞结合的EdU(5-乙炔基-2‘-去氧尿苷)，发现与BST2阴性年老aNSCs/NPCs亚群相比，BST2阳性年老aNSCs/NPCs亚群与EdU的结合减少，Ki-67(另一种周期中细胞的标记)的染色也降低(图5c)；

❖ 神经源性小生境中，与T细胞紧邻着的NSCs中BST2增加(图5d, e)；

❖ 免疫荧光、FACS分析体外共培养的CD8+ T细胞和NSCs(从年轻小鼠大脑中分离得到)，结果显示加入T细胞和促进T细胞产生INF-γ的细胞因子能引起NSCs表达BST2，NSC增殖显著降低，而加入中和INF-γ的抗体后这一情况得以逆转(图5f, g和h)。

但是，体内的其他细胞如小胶质细胞或内皮细胞也可能导致了NSC的调控异常，这仍需进一步的研究。

图5 T细胞分泌的INF-γ对NSCs有不利影响。a是4只3个月大年轻和4只24个月大年老小鼠aNSCs/NPCs中BST2荧光的FACS直方图；b是4只24个月大年老小鼠BST2阴性和阳性aNSC/NPCS的bulk转录测序数据进行标志基因集富集分析的结果；c是年老小鼠BST2阴性和BST2阳性年老aNSCs/NPCs(各约100个细胞)中，Edu阳性细胞比例的FACS定量结果；d是29个月大年老小鼠SVZ部分的免疫荧光染色；e是3只29-30个月大年老小鼠SVZ区域中紧挨着或不紧挨着CD3+ T细胞的NSCs的BST2荧光定量结果；f是共培养的T细胞和NSCs图解；g是与T细胞和细胞因子共培养的3个月大年轻小鼠的NSCs，在有或没有INF-γ中和抗体情况下的免疫荧光染色；与脾脏CD8+ T细胞共培养NSC(每个点代表着约1,000个细胞的结果)，在有或没有INF-γ中和抗体情况下，BST2阳性(h)和EdU阳性(i)NSCs比例的FACS定量结果。

随着年龄增加，T细胞能够浸入神经源性小生境，且这些克隆扩增的T细胞可能是识别年老大脑中新抗原(包括年老NSCs中聚集的蛋白质)产生的【16】。而年老神经源性小生境中的其他细胞，如小胶质细胞【34】、内皮细胞【35】和巨噬细胞【36】等，可能提供了吸引T细胞的趋化因子。

T细胞表达INF-γ，而神经源性小生境中的几种细胞(包括NSCs)表现出对INF-γ的响应。在体内和体外，这种T细胞引起的INF-γ响应似乎对NSC功能有不利影响。虽然仍需建立T细胞、干扰素和NSC增殖间的准确联系，但是该研究结果为随年龄增加NSC减少提供了一个可能解释，有助于开发能够改善年龄相关认知损害的疗法。

得益于高分辨度的单细胞RNA测序技术，科学家能够了解每一个细胞的特征及其参与的活动。

在该项研究中，研究者通过对不同年龄SVZ小生境进行单细胞RNA测序分析，发现了随着年龄增加，脑功能衰退的可能机制：浸入的T细胞识别SVZ小生境中抗原后进行克隆扩增，这些T细胞分泌的干扰素直接抑制周边NSCs的增殖，导致神经细胞数量减少。

此外，“教科书认为免疫细胞不能轻易进入健康大脑，这在很大程度上是正确的，”遗传学教授以及该研究的通讯作者Anne Brunet说到。“但是我们的结果不仅展示了免疫细胞确实能进入健康老化大脑(包括人类大脑)，还可以到达大脑中新神经元出现的区域。”

Anne Brunet教授及其团队正尝试确定年老小鼠神经源性小生境中引起T细胞克隆增殖的抗原，他们相信这一结果能帮助开发抵消年龄相关脑功能衰退的疗法。

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