●文献解析|Science—scRNA-seq揭示水螅再生机制
法国画家Gustave Moreau《Hercules and the Lernaean Hydra》作品中的Hydra，现存于芝加哥艺术博物馆
仅有几毫米的Hydra即使被切成两半，也能在几天内（大概两天内）再生出完整的身体和神经系统【1】。事实上，17世纪早期，Hydra这一独特特性就被Anton van Leeuwenhoek和Abraham Tremblay所描述、研究，被认为是最初的“模式生物”之一【2】。
Stefan Siebert博士拍摄的Hydra
Hydra的身体约有100,000个细胞，由于它的干细胞处于持续再生状态，令其具有了非凡的再生能力——这些细胞会每20天再生一次，这在生物学上几乎是永生的【1】。但是，这些干细胞如何成为特化细胞（如神经元或皮肤细胞）的呢？此外，Hydra干细胞使用了哪些遗传决策？
为此，UC Davis大学分子与细胞生物学系的助理教授Celina Juliano、Stefan Siebert博士及其同事，与哈佛大学的博士后Jeff Farrell合作，使用单细胞测序技术对近25,000个Hydra细胞的遗传轨迹进行分析，揭示了持续更新细胞的3种不同干细胞聚群来源及其分化的决策树样过程【3】。该研究成果2019年发表于《Science》。
Hydra存在3种细胞谱系——内胚层上皮细胞、外胚层上皮细胞和间质细胞，而每种谱系由各自干细胞群支撑【4】。Hydra身体中所有的上皮细胞是有丝分裂单能干细胞，能分化成体底端的足以及口端的垂唇和触手，并进行持续更新【5】。多能的间质干细胞（ISCs）能产生3种体细胞型——刺细胞、神经元和腺细胞【6-8】。此外，存在3种机制维持间质细胞持续更新：ISCs、祖细胞和腺细胞的有丝分裂【8】；ISC分化成神经元、刺细胞和腺细胞【9-10】；以及改变某一位置上神经元/腺细胞的表达和功能。
为了深入理解Hydra细胞分化模式及其背后的分子机制，研究者使用scRNA-seq技术分析了40~50个Hydra的近25,000个单细胞转录组，并采用FISH、免疫组化和转基因谱系等方法对生物标记及细胞状态进行确认。同时，根据前人研究和RNA原位杂交实验确定沿口-底端轴向差异表达的基因，研究者定义了细胞的空间位置，据此对伪时间分析结果进行再次分析，按照口-底端顺序展示某些基因表达水平的变化，初步绘制了Hydra细胞的基因空间表达图谱。
总之，Juliano教授和Siebert博士的这些发现将极大地推进对Hydra发育过程的认识。
1.对整个Hydra进行scRNA-seq揭示了细胞状态的转变
对得到的单细胞数据进行降维聚类分析，研究者发现3种细胞谱系中存在多种预期的细胞群。原位杂交实验结果证实了研究者捕获到了处于不同分化状态的细胞。
此外，降维聚类t-SNE图中明显存在多种细胞分化轨迹（图1）：
► 分化成头和足的上皮细胞与相应的身体干细胞聚群相连；
► ISCs聚群与神经祖细胞和刺丝原细胞相连；
► 间质细胞谱系存在不同的分化细胞聚群，即神经元、刺细胞和生殖细胞；
图1 对t-SNE降维聚类图中的细胞聚群进行细胞状态注释的结果【3】。其中，ec，外胚层的；en，内胚层的；Ep，上皮细胞；gc，腺细胞；id，整合双重态；mp，多能的；nb，刺丝原细胞；nem，分化的刺细胞；pd，疑似吞噬功能双重态；prog，祖细胞。id、mp和pd意味着生物上的双重态。箭头意味着干细胞群向分化细胞的转变。
2.重建上皮细胞轨迹揭示了位置依赖性的基因表达
当上皮细胞向身体两端和四周分散时，不断根据自身位置调整基因表达。为了确定这一依赖位置的基因表达模式，研究者对内胚层和外胚层上皮细胞进行了轨迹分析（按照口-底端轴向顺序）。
根据前人研究结果和RNA原位杂交实验确定的基因的空间表达模式，研究者对轨迹分析结果进行展示，发现了口和底端处终末分化上皮细胞的可能调控因子。如沿着体轴，发现Wnt、BMP和FGF信号通路中存在差异表达基因，这为采用功能测试来更好的认识Hydra口-底端模式提供了参考（图2）。
A
B
3.确定多能间质干细胞，重建间质细胞谱系轨迹
研究者发现间质细胞谱系内不同细胞类型间存在异质性：
► 含有卷刺丝囊或钩刺丝囊的刺细胞存在基因表达差异（图3）；
► 间质细胞的亚集中存在两个雄性生殖细胞聚群和两个雌性生殖细胞聚群（图3）；
图3 间质细胞谱系的降维聚类及轨迹分析结果【3】。
► ZMGs（胃层的腺细胞）遍布整个Hydra，当位于头部时分化成gMGCs（颗粒状粘液腺细胞），展现出依赖位置的基因表达变化（图4A）；
► sMGCs（泡状粘液腺细胞）的基因表达也存在口-底端变化（图4B）；
A
B
图4 腺细胞的分析结果【3】。A图是ZMG和gMGC的位置依赖性变化模型，及其轨迹分析结果；B图是sMGCs轨迹分析结果。
4.识别特定细胞状态下，调节模块的可能转录调控因子
为了确定共表达基因集合共有的转录因子结合位点和与这些位点结合的候选转录因子，研究者分析基因组数据集和ATAC-seq得到的数据，发现：
► 39个细胞聚群的共表达基因集合富集着不同的基序，表明不同细胞状态的转录因子不同；
► 刺细胞形成早中期表达基因的调节区域富集了Pax基序，中晚期富集了Fox基序，但POU基序只在晚期富集；
► 雌性生殖细胞中富集了EBF基序；
► 神经元和腺细胞中富集了TCF基序；
► 不同状态上皮细胞富集的基序差异不大，但两端处的（触手和足）内外胚层上皮细胞中富集了ETS域结合基序；
► Otx、Arx和bZip基序在所有上皮细胞谱系中富集，而Fox基序似乎与内胚层上皮细胞的基因表达有关；
► Fox基序在Hydra内胚层和Nematostella胃丝中富集，这与两侧对称动物中观察到Fox转录因子的保守功能相一致【11-12】；
图5 对于所列的细胞状态，染色质开放的顺式调节区域中发现的部分富集基序【3】。
► 25个基因集合中，每个集合有1个或多个在细胞命运特化中可能起作用的候选转录因子。如刺细胞形成期间共表达的73个基因组成了wg32基因集合，在该基因集合附近的潜在调节区域显著富集了Pax转录因子结合基序。其中转录因子Pax-A（t9974）属于wg32，暗示刺细胞形成早期Pax-A的功能，这与近期在Nematostella发育期间发现的刺细胞形成需要Pax-A相一致【11,13】。
图6 刺细胞形成期间共表达基因集合wg32和可能的PAX调控因子。左侧是wg32基因集合的分数（73个共表达基因），底部是顺式调节区发现的显著富集的Pax基序，右侧是可能与Pax基序结合的候选调控因子Pax-A表达水平。
5.Hydra神经系统的分子图谱
Hydra存在两个位于中/外胚层的上皮层中的神经网，而神经元集中于口和基底【14】。为了确定神经元亚型的分子特性，研究者对神经祖细胞和分化的神经元进行分析，发现（图7）：
► 15个聚群中，有3个聚群是由神经祖细胞组成，表达祖细胞基因，如Myb/myc3，其余12个聚群是分化的神经元亚型；
► 根据神经元聚群的标记基因和选定的基因，对降维聚类结果进行注释，确定了外胚层神经元亚型在口-底端轴上的位置；
根据前人对Hydra神经元回路研究结果【15】和研究者确定的神经元分子亚型（图6A），研究者提出：内胚层神经元聚群en1组成了RP2（节律潜能2）回路；神经元聚群ec3A、ec3B和ec3C组成了RP1（节律潜能1）回路；神经元聚群ec1A、ec1B和ec5组成了外胚层CB（伸缩）回路。
根据对间质细胞谱系的研究（图1，图3AB），研究者提出两个模型：多能ISCs首先在刺细胞或腺细胞/神经元命运间做出决定，接着由腺细胞/神经元祖细胞进行第二次决策，这与前人研究不同【16】，但仍需进一步实验验证；双能腺细胞/神经元祖细胞产生于外胚层，在此驻留的多能ISCs穿过胞外基质为内胚层提供腺细胞和神经元（图3）。
通过使用单细胞测序技术，研究者得以绘制水螅3种干细胞发育谱系的“单细胞分子图谱”，并首次提供了水螅神经系统的基因表达谱【1】。
“单细胞测序的魅力在于我们可以真正的捕捉干细胞分化成不同细胞类型过程中表达的基因，这对发育生物学家来说十分重要，”分子与细胞生物学系的助理教授Celina Juliano说到。
“所有生物体都具有损伤响应途径，但在某些生物体如水螅中，会引起再生，”该研究的共同作者Abby Primack说到。“在其他生物体，如人类中，一旦我们的大脑受伤很难恢复，因为大脑缺乏在水螅中观察到的某种再生能力。”
单细胞测序技术使研究者获得“完整组织测序时被掩盖的信息”，帮助研究者深入认识、挖掘水螅如何再生其整个神经系统，这有助于开发针对人类退行性疾病的新疗法。
参考文献
2.Hydra 2.0 Genome Project Portal. website: https://research.nhgri.nih.gov/hydra/.
3.Siebert S, et al. (2019). “Stem cell differentiation trajectories in Hydra resolved at single-cell resolution.” Science,365(6451): eaav9314.
4.Bosch, T. C. G., et al. (2010). "The Hydra polyp: nothing but an active stem cell community." Development, growth & differentiation 52.1: 15-25.
5.Holstein, T. W., et al. (1991). "Pattern of epithelial cell cycling in hydra." Developmental biology 148.2: 602-611.
6.Bosch, T. C. G. & Charles N. D. (1987). "Stem cells of Hydra magnipapillata can differentiate into somatic cells and germ line cells." Developmental biology 121.1: 182-191.
7.Nishimiya-Fujisawa, C. & Satoru K. (2012). "Germline stem cells and sex determination in Hydra." International Journal of Developmental Biology 56.6-7-8: 499-508.
8.David, C. N. (2012). "Interstitial stem cells in Hydra: multipotency and decision-making." International Journal of Developmental Biology 56.6-7-8: 489-497.
9.David, C. N. & Susan M. (1977). "Characterization of interstitial stem cells in hydra by cloning." Developmental biology 58.2: 372-383.
10.Bode, H. R., et al. (1987). "Gland cells arise by differentiation from interstitial cells in Hydra attenuata." Developmental biology 122.2: 577-585.
11.Sebé-Pedrós, A., et al. (2018). "Cnidarian cell type diversity and regulation revealed by whole-organism single-cell RNA-Seq." Cell 173.6: 1520-1534.
12.Grapin-Botton, A. & Daniel C. (2007). "Evolution of the mechanisms and molecular control of endoderm formation." Mechanisms of development 124.4: 253-278.
13.Babonis, L. S. & Mark Q. M. (2017). "PaxA, but not PaxC, is required for cnidocyte development in the sea anemone Nematostella vectensis." EvoDevo 8.1: 14.
14.Bode, H., et al. (1973). "Quantitative analysis of cell types during growth and morphogenesis in Hydra." Wilhelm Roux'Archiv für Entwicklungsmechanik der Organismen 171.4: 269-285.
15.Dupre, C. & Rafael Y. (2017). "Non-overlapping neural networks in Hydra vulgaris." Current Biology 27.8: 1085-1097.
16.Miljkovic-Licina, M., et al. (2007). "Head regeneration in wild-type hydra requires de novo neurogenesis." Development 134.6: 1191-1201.
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