单细胞空间转录组测序|Cell—小鼠原肠胚形成中期RNA空间模式

原肠运动是高等动物早期发育阶段一个极其重要且高度保守的生物学过程。多潜能的早期胚胎在原肠运动中发生了剧烈的细胞增殖和细胞迁移，分化成外、中、内三个主要的胚层，成为全部体细胞的前体。此过程确立了整个胚胎的发育蓝图，并且不同细胞在胚胎中的空间位置决定了其未来的分化潜能和发育方向【1】。

小鼠胚胎E6.5-E7.5变化【9】

因此，对早期胚胎进行空间位置特异的转录组分析，可以解析早期胚胎发育命运决定的分子机制，对预防相关的早期发育疾病也有十分重要的意义【1】。

中国科学院上海生命科学研究院、生物化学与细胞生物学研究所景乃禾研究组与中国科学院-马普学会计算生物学伙伴研究所韩敬东研究组合作，开发了一种新的单细胞空间转录组技术，并研究了小鼠原肠胚形成中期上胚层转录组的空间变化。

这一研究结果发表于2016年的Developmental Cell，并成为当期的亮点文章。

影响因子：9.19

第一作者：Guangdun Peng

通讯作者：中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所景乃禾研究员与中国科学院-马普学会计算生物学伙伴研究所韩敬东研究员

通讯作者实验室：韩敬东研究员实验室主页

开放数据库：文章中使用的数据存储于NCBI，编号GSE65924；小鼠原肠胚形成中期上胚层转录组时空变化web数据平台，iTranscriptome。

原肠胚形成是哺乳动物早期胚胎形成的重要标志事件。对原肠胚形成时期特异基因组转录活性的整体认识，是更好的理解谱系特异性和胚胎发育模式背后分子机制的关键【2】。然而，当时对原肠胚形成过程中分子发生的时空变化还不完全清楚。

因此，研究者对小鼠原肠胚形成中期(E7.0 原条阶段中晚期)上胚层进行单细胞空间转录组测序，展示了整个上胚层转录组的空间结构，并将3个原肠胚形成中期胚胎、超过20,000个基因的空间和表达水平数据整理成web数据库——iTranscriptome，实现了特定基因表达模式的可视化。此外，iTranscriptome上还绘有独特的zip code基因，据此可以确定上胚层分离出的单个细胞的位置，并确定该细胞所属的胚胎来源干细胞群。

研究者首先使用激光捕获显微切割(LCM)【3】获取原条中晚期(E7.0)小鼠胚胎样本，绘制上胚层不同区域细胞群的基因表达模式。

为了减少胚胎间异质性导致的转录组数据差异对研究结果造成的干扰，研究者对3个胚胎进行了分析。将胚胎包裹在OCT冰冻切片包埋剂中进行低温显微切片，将其切成15um的厚度一系列切片(图1A)。

其中S1-S11作为样本，每个包含4个位置，分别是前部(A)、后部(P，包含原条)、左侧(L)及右侧(R)。为了提高RNA测序效率，研究者采用优化后的smart-seq2 protocol对每个位置获取的近20个细胞进行RNA测序(S1只捕获了前部和后部的细胞)。

每个文库测序深度超过2千万个reads。移除测序质量低的样本后，对3个胚胎进行了数据分析。胚胎E1为数据挖掘提供了参考转录组，缺失数据由计算机模拟重建(图1B)。

每个胚胎中约存在13,500～14,500个基因(每个胚胎至少两个切片中，该基因的FPKM>1.0)，3个胚胎共检测到约20,000个基因，每个位置处有相似的表达密度分布(图1C)。

余下的R1-R11作为3D建模模板，用于绘制可视化的3D胚胎玉米图(图1A)。

图1 原肠胚形成中期胚胎的空间RNA测序分析【2】。其中A是实验设计；B是参考胚胎E1中，计算机重建3A位置数据的方法；C是每个样本切片不同位置处的基因表达密度。

整体原位杂交(WISH)是一种研究原肠胚形成阶段小鼠配天基因表达空间模式的最常用的、低通量的基因-基因法。而研究者开发的算法将RNA-seq数据与细胞群准确位置相结合，得以按照WISH样式重建单个上胚层中每个转录本的半定量3D表达谱。

圆柱形胚胎以2D结构展示，玉米图(因其与玉米棒相似而命名)中网格节点表示样本的坐标(A、P、R、L及1-11)(图2A)。

通过比较多个基因的RNA-seq数字化展示结果与传统WISH结果，发现：

❖ 玉米图能可靠地模拟基因空间表达模式(图2B)；

❖ 表达水平较低的基因或在一个给定区域中，d-WISH分析比WISH的灵敏度更高(图2C)；

此外，研究者建立了iTranscriptome网站为科学团体提供空间转录组数据。该网站可允许用户搜索感兴趣的基因的表达模式、具有相似表达模式的多个基因、用户选择的或数据库自定义的基因集的表达模式以及根据zip code基因查询细胞在上胚层中对应位置。

图2 原肠胚形成中期胚胎的空间RNA-seq分析【2】。其中A是玉米图形式的基因表达空间模式；B上部分是胚胎左侧T基因表达的WISH结果，下部分是根据RNA-seq中T基因数据构建的胚胎模板及玉米图d-WISH结果；C是比较不同基因的WISH及d-WISH结果，下方小图显示的是样本11A中Six3的RNA-seq数据(IGV软件)。

每个胚胎样本内，在至少两个样本切片中表达(FPKM>1.0)且所有样本切片间的转录水平差异>0.05的基因被用于进一步分析，以确定原肠胚形成中期胚胎的转录组域。分析结果显示：

❖ 无监督分层聚类结果显示存在4个空间表达域(D1-D4)，它们的基因表达模式不同(图3A)；

❖ 原肠胚形成中期胚胎上胚层可以划分成4个不同的基因活性域，每个域与样本的A、R、L、P空间分布有着显著的一致性(图3B)；

❖ A(D1)位置与远端侧位置(D2)间的联系更为密切，表明这两个域具有发育一致性(图3A、3B)；

❖ 原肠胚形成中期胚胎的空间转录组及空间表达域图谱是可重复且一致的(图3C)。

图3 空间转录组揭示了原肠胚形成中期胚胎的转录域。其中A是差异表达基因(DEGs)的聚类结果；B上部分是胚胎中4个表达域及域的3D展示图，下部分是上胚层4个解剖位置的DEG聚类结果；C是3个胚胎样本间，不同域间DEGs表达谱的Spearman秩相关系数分析结果。

从差异表达基因(DEGs)中选取能解释42个样本间转录组差异的最少数量基因集进一步分析，发现：

❖ 存在3个基因集G1-G3，其中G3显示出上胚层A与远端侧面位置存在联系(图3A)；

❖ GO及KEGG通路富集结果显示，G1高度富集了WNT信号通路调控下的胚胎形态发生和模式特化相关基因，G3富集了“神经系统进展调控”及“紧密连接”功能的基因，G2富集了细胞周期及代谢功能相关基因【4-5】，这些功能与已知的胚胎位置处发育进展相一致(图3A、4A)；

❖ 选择6个DEG进行WISH，结果显示原条阶段中晚期小鼠胚胎的左-右不对称尚未建立(图4B)；

❖ 对42个样本的top40 DEGs进一步聚类，发现存在4个模块域(MD1-MD4)及4个模块基因家族(MG1-MG4)。MD1-MD4与D1-D4相对应(图4C)；

❖ MG1-MG4是一个更小的“位置特异性”基因集，足以用于描述上胚层每个表达域(MD1-MD4)的特征(图4C)；

❖ PC1轴确定了上胚层A及P位置的基因集，使用WISH分析确认了基因集内包含的域特异性基因标记，这意味着空间转录组能允许研究者发现可能的、特定空间的谱系标记(图3A、4D、4E)；

❖ PC2轴确定了A/P(D1/D4)及远端侧域(D3)间差异表达的基因集(图4F)；

❖ 基因集富集分析(GSEA)结果显示，PC1轴富集了发育相关通路，而PC2轴富集了细胞生长和代谢相关通路，表明上胚层细胞的不同功能属性(图3A、4E、4F)；

❖ 对E1 LCM样本进行了微流控多通路qPCR，验证了基因集(数量最少)具有空间表达差异(图4G)。

无监督分层聚类分析及PCA分析结果均确定原肠胚形成中期胚胎的上胚层中存在4个空间表达域，这可能与不同功能属性基因集表达活性的区域差异有关。

图4 A是G1-G3基因集的GO及KEGG通路富集分析结果；B是WISH分析结果显示选择的6个DEGs没有可辨别的空间(左-右)表达差异；C是top40 DEGs的聚类结果；D是玉米图中新发现的区域特异性基因的WISH验证结果；E图显示的是每个基因对PC1和PC2的贡献率；F是PC1和PC2轴上基因集进行的GSEA；G是qPCR数据分析结果，证实了基因集(数量最少)具有空间表达差异【2】。

为了检验空间转录组能否揭示上胚层A和P位置细胞命运区域化相关基因的表达活性，研究者选取了A和P位置DEGs中，与PC1及PC2 cos2相关性最高的基因，称其为seed标记基因。随后，筛选出与seed标记基因共表达的基因组成基因集。对该基因集进行分析后发现：

❖ GSEA结果显示，A位置seed标记基因Pou3f1的共表达基因集与神经元发育有关，而P位置seed标记基因Mixl1的共表达基因集与模式特化有关(图5A)；

❖ P位置共表达基因集聚类分析结果显示，存在3个亚域(PD1-PD3)以及4个基因聚群(PG1-PG4)，PG的基因功能与原条细胞的中胚层命运区域化相匹配【6】(图5B)；

❖ GSEA结果显示PG与WNT信号影响下的中胚层特化有关(图5B)；

❖ 每个PD的top5基因空间表达模式能将亚域区分开(图5C)；

❖ A位置分析结果显示，存在3个亚域(AD1-AD3)以及4个基因聚群(AG1-AG4)(图5D)；

❖ 与P位置分析结果不同的是，一些基因在A位置样本间表现出一致的表达模式，导致GSEA结果不能很好地揭示这些亚域的功能，意味着与P位置相比，A位置的细胞谱系命运尚未分开(图5D)。

图5 上胚层A和P位置的亚域【2】。A是A位置和P位置上的top30共表达基因集；B是P位置样本共表达基因集降维聚类结果得到的3个PD和4个PG；C是PD1-PD3中top5基因的玉米图；D是A位置样本共表达基因集降维聚类结果得到的3个AD和4个AG。

为了描述上胚层转录调控网络的特性，研究者对DEGs中所有发育相关的转录因子(TFs)进行分析，发现：

❖ TFs形成4个不同的模块TF群(TC1-TC4)及4个基因聚群(TC1-TC4)(图6A、6C)；

❖ TC2-TC4表现出P位置特异性表达模式，而TC1仅在A位置表达，这种模式表明这些TF在上胚层中的功能不同(图6B)；

❖ A位置(TC1)和P位置(TC2)的TC存在明显的负相关【7】，意味着这些TFs促进不同位置细胞获得不同的细胞身份(图6C)；

❖ 所有差异表达TF的GSEA分析结果表明，A11TC2模块富集了代谢相关通路，这些“代谢”和“细胞周期”功能基因集可能对A和P位置处细胞命运的分化有重要影响(图6D)。

图6 转录因子调控网络分析【2】。A是发育相关TFs的聚类结果；B是TC1-TC4平均表达水平玉米图；C是发育相关TFs的共表达网络；D是A11TC1-A11TC3模块的GO富集分析结果。

为了绘制上胚层信号通路活性图谱，研究者分析了WNT、BMP、FGF及Nodal通路相关基因的富集程度，发现：

❖ G1显著富集了WNT、BMP及Nodal通路相关基因，FGF信号通路没有明显的空间富集模式(图7A)；

❖ P位置上的关键信号通路因子表达增加，包括ligands、targets及antagonists(图7B)；

❖ 上胚层A位置处缺乏FGF/Wnt/Nodal活性，在上胚层A近端及外侧检测到BMP应答基因的表达(图7B)；

❖ 空间转录组揭示的区域化信号通路活性与胚层标记(区域特异性表达)所指定的细胞谱系命运相关(图7C、D)。

基因表达模式与上胚层特定位置处细胞未来谱系命运存在联系，这为根据zip code追溯外源细胞的类型以及其在原肠胚形成中期外胚层上的位置提供基础。

图7 信号调控网络【2】。其中A是G1-G3中发育相关信号通路靶基因的富集结果；B是每个样本中，发育相关信号通路关键组成基因的表达模式玉米图；C是空间转录组揭示的BMP、Wnt及Nodal信号活性玉米图；D是区域化的细胞命运玉米图。

研究者将胚胎样本E2和E3与参考胚胎样本E1进行了比较，发现域特异性信号基因集在不同胚胎中具有良好的一致性，因而确认MG1-MG4(图4E)可用于确定细胞在上胚层中的位置(图8)。

图8 表格中展示的是根据域特异性信号基因集表达水平，预测E2和E3不同位置样本属于哪个域(D1-D4)的准确率【2】。

为了演示zip code图谱的用途，研究者从一个原肠胚形成中期胚胎上胚层的A及P位置(每个位置包含了部分侧面域)分离出70个单细胞，进行单细胞RNA测序并根据zip code图谱确定每个细胞的位置。结果显示可以较准确的得到66个细胞的采样位置(图9)。进一步的验证及算法优化显示出zip code可用于确定外源单个细胞的位置。

图9 根据zip code绘制的单个细胞位置结果【2】。

此外，研究者模拟了70个细胞的zip code图谱，并将其与iTranscriptome上的空间表达模式进行比较，进一步评估了zip code图谱的准确性(图10)。结果显示仅少部分zip code基因的预测效果较差。

图10 iTranscriptome网站中(上)及使用70个细胞模拟的zip code基因表达模式(下)【2】。

随后，研究者使用zip code图谱确定10个胚胎来源的及1个胚胎干细胞来源的EpiSC系(上胚层干细胞系)【8】在上胚层细胞群中的位置，发现中内胚层特性的EpiSC更多的表现出上胚层P位置处的转录特征(图11 i-iii，图7D)，而外胚层特性的EpiSC与上胚层A及远端侧面位置更相似(图11 iv、v，图7D)。

图11 EpiSC的zip code图谱等同于5种不同的体内上胚层细胞群空间表达模式【2】。

这些数据表明，zip code图谱可用于描述胚胎来源干细胞的细胞命运谱，如上胚层干细胞。

研究者开发了一种名为单个胚胎空间RNA测序法的技术，能获取单个胚胎中细胞样本的转录组及其位置信息。

研究者绘制了原肠胚形成中期胚胎，上胚层中超过20,000个基因的空间表达谱，并以3D形式展现出来。同时，描述了上胚层中域(D1-D4)的表达特征，确定了每个域的特异性标记基因(MG1-MG4)，还推断了上胚层中的TFs和信号通路关系网络。

iTranscriptome提供了前所未有的信息资源，包括上胚层细胞的谱系状态和分化轨迹，以及对谱系特化和分化十分重要的转录因子和信号通路基因集。iTranscriptome提供的信息对认识胚胎形成机制和干细胞生物学属性具有重要应用价值。

对早期胚胎进行空间位置特异的转录组分析，可以解析早期胚胎发育命运决定的分子机制，这对预防相关的早期发育疾病有十分重要的意义，还为认识干细胞的全能性与分化潜能以及干细胞转化医学应用提供了全新的视角和理论指导【1-2】。

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参考文献

1.叶瑞优(编辑). (2016). “上海生科院等建立小鼠早期胚胎空间转录组图谱”.

http://www.cas.cn/syky/201603/t20160322_4550463.shtml.

2.Guangdun P., et al. (2016). “Spatial Transcriptome for the Molecular Annotation of Lineage Fates and Cell Identity in Mid-gastrula Mouse Embryo.” Cell., 36(6): 681-687.

3.Downs K.M. & Davies T. (1993). “Staging of gastrulating mouse embryos by morphological landmarks in the dissecting microscope.” Development., 118: 1255-1266.

4.Lawson K.A., et al. (1991). “Clonal analysis of epiblast fate during germ layer formation in the mouse embryo.” Development., 113: 891-911.

5. Snow M. (1977). “Gastrulation in the mouse: growth and regionalization of the epiblast.” J. Embryol. Exp. Morphol., 42: 293-303.

6.Tam P.P. & Loebel D.A. (2007). “Gene function in mouse embryogenesis: get set for gastrulation.” Nat. Rev. Genet., 8: 368-381.

7.Xue H., et al. (2007). “A modular network model of aging.” Mol. Syst. Biol., 3: 147.

8.Zhang K., et al. (2010). “Distinct functions of BMP4 during different stages of mouse ES cell neural commitment.” Development., 137: 2095-2105.

9.Katie McDole, et al. (2018). “In Toto Imaging and Reconstruction of Post-Implantation Mouse Development at the Single-Cell Level.” Cell., 175(3): 859-876.

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