单细胞RNA测序技术揭示癌症发生发展过程

图源网络

自然界中的万事万物都都有着自己的发生发展规律，如种子破土长成参天大树、蒲公英随风凋零。相似的，肿瘤细胞也是经历了独特的“发展”过程才“演变”而来。

癌细胞是正常细胞突变而来，因而既具有癌细胞无限增殖等特性，又具有正常细胞的某些特征。因此，确定正常细胞转化为癌细胞的关键驱动基因及转化过程中的细胞转录组变化，可以帮助描绘癌症发生发展图谱，并有助于开发新的、高效的、高特异性的诊疗及预后手段。

但是，癌症的高度异质性及某些癌组织的相对不可获得性，使得传统的转录组测序技术难以快速获取详细的癌症发生发展图谱。这是因为传统的转录组测序技术检测的是样本内许多细胞的转录组平均水平，导致单个细胞间转录组的细致变化难以展现，影响了对癌症发生发展过程的认识。

单细胞RNA测序技术的出现，为癌症研究带来了新机遇。通过使用伪时间轨迹法对单个细胞间转录组的变化过程进行模拟，研究者可获得各个细胞之间的相互关系，进而帮助构建癌症的发生发展过程，为攻克癌症这一疑难杂症提供高可信度的基础资料。

本期将介绍两个应用实例——儿童小脑肿瘤及胰腺导管腺癌。

—

儿童小脑肿瘤——原发性癌症的细胞起源

不同癌症发生的关键驱动突变基因不同，因此这种突变基因可以作为诊疗/预后的标记基因，如KARS基因之于胰腺导管腺癌【1】。但是小儿脑瘤不同于其他肿瘤，基因突变较少且病情发展迅速【2-8】，这是“导致该疾病的治疗发展远落后于其他癌症类型”的重要原因。

小儿脑瘤常见于颅后窝，特别是小脑，该区域常出现MB（髓母细胞瘤）、室管膜瘤和PA（纤维性星形细胞瘤）。小脑肿瘤基因突变少意味着小脑肿瘤细胞与其祖细胞较为相似，因而可通过比较小脑肿瘤和正常小脑细胞的转录组差异，认识肿瘤发生发展过程中细胞系转录组及关键基因的变化过程。

但发育早期小脑的巨大变化和头骨内小脑组织的相对不可获得性又限制了对正常发育小脑的研究，这加剧了小脑肿瘤研究难度。为此，Vladoiu等（2019，Nature）【9】通过比较不同发育阶段小鼠模型的小脑单细胞测序结果，以及人肿瘤样本的bulk和单细胞测序结果，对3种儿童小脑肿瘤——MB、PA以及室管膜瘤展开研究。

图1 Vladoiu等【9】的伪时间分析研究思路。

Vladoiu等【9】首先通过单细胞测序分析不同发育阶段小鼠模型的正常小脑组织，构建了不同发育时期小鼠模型小脑细胞谱系的分化过程（图2）。

图2 小鼠模型小脑细胞谱系分化轨迹【10】。

随后，对4个儿童PFA（室管膜瘤的一种亚型）肿瘤样本进行单细胞测序。反卷积法比较PFA与不同发育时期小鼠模型小脑细胞基因集中的人/鼠直系同源基因后，伪时间轨迹分析发现PFA内不同细胞亚群的伪时间轨迹与反卷积后得到的伪时间轨迹相似（图3），表明PFA内细胞亚群的分化程度较低。

图3 儿童PFA内不同细胞聚群的“分化”轨迹图【9】。A图是根据儿童PFA室管膜瘤样本单细胞测序数据得到的伪时间轨迹分析结果，B图是根据小鼠模型小脑细胞的基因集反卷积分析后得到的PFA室管膜瘤不同细胞聚群的“发育分化轨迹”【10】。

通过与不同发育时期小鼠小脑细胞进行反卷积比较，伪时间轨迹分析结果直观地表现了儿童小脑肿瘤细胞的转录组与不同发育时期小鼠模型小脑细胞的转录组变化过程具有较高相似性，这支持了细胞来源影响肿瘤的转录组和生物学特性这一假设。

—

胰腺导管腺癌——原发性癌症的细胞起源

PDAC（胰腺导管腺癌）具有浸润性特征，70%以上PDAC细胞是嵌入在正常胰腺组织中的，因而PDAC具有高度的肿瘤内异质性【10】。这使得采用传统转录组测序技术难以获得可靠的PDAC遗传变异信息，影响对PDAC发生发展的认识。

Peng等（2019，Cell）【11】通过对来自24个原发性PDAC肿瘤和11个对照胰腺中，共57,530个细胞进行单细胞转录组测序，帮助认识PDAC肿瘤内异质性并探究PDAC的发生机制。

一些研究认为PDAC的恶性肿瘤细胞来源于导管细胞【12,13】，但也有研究认为PDAC主要来源于胰腺泡细胞【14,15】。为了探究PDAC癌细胞的来源，Peng等【11】对PDAC样本中存在的1型导管细胞、2型导管细胞和腺泡细胞进行轨迹分析。结果显示腺泡细胞和MU1低表达的1型导管细胞可以过渡到MUC1高表达1型导管细胞，进而转化成2型恶性导管细胞（图4）。

图4 轨迹分析结果显示PDAC样本中的腺泡细胞和1型导管细胞逐渐过度到2型恶性导管细胞【11】。

由于从PDAC样本中仅获得512个腺泡细胞，因此作者只构建了异常导管细胞（1型）和恶性导管细胞（2型）基因表达模式的伪时间轨迹（图5）。可以发现，在1型导管细胞向2型导管细胞转化的过程中，上皮细胞标记基因EPCAM在整个转化阶段保持高表达，而MUC1的表达水平随PDAC发展逐渐增加（图5）。

图5 PDAC样本中导管细胞的伪时间轨迹分析结果，以及导管细胞中EPCAM和MUC1基因表达水平的伪时间轨迹分析结果【11】。

此外，PanIN（胰腺上皮内瘤变）被认为是最常见的具有导管形态的瘤前粘液性病变，但对PanIN分子水平特征的认识较为缺乏。为此，作者通过免疫染色和标记基因注释方法，确定2型导管细胞中存在PanIN态的细胞（细胞亚群1～3）后，对2型导管细胞进行轨迹分析，发现多数处于PanIN态的细胞出现在PDAC早期发展阶段（图6），暗示PanIN态细胞可能过渡成2型导管细胞。

图6 PDAC样本中2型导管细胞的轨迹分析图。结果暗示PanIN可能过渡成2型导管细胞【11】。

通过使用伪时间轨迹分析，作者发现了PDAC中2型恶性导管细胞的可能来源及发生过程，并找到1型导管细胞和腺泡细胞转化成2型恶性导管细胞过程中的可能关键基因，为PDAC的诊断及预后手段的开发提供了新思路。

—

总结

伪时间轨迹分析根据关键基因集表达水平的变化，在假定的时间中对单个细胞进行排序，模拟单个细胞转录组随“时间”产生的变化。结合单细胞RNA测序技术，该分析方法能清晰地展现单个细胞间转录组的变化过程，帮助推断癌症发生发展过程中细胞的“分化”轨迹或细胞亚群间的相互转化，继而有利于诊疗及预后手段的开发（图7）。

图7 单细胞RNA测序数据伪时间轨迹分析的应用优势

绘真医学RedRock^TM 超高通量单细胞转录组测序分析报告可根据您的研究需要进行伪时间轨迹分析，为您的研究提供有力支持！

参考文献

1．Hezel, A. F., et al. (2006). “Genetics and biology of pancreatic ductal adenocarcinoma.” Genes & Development 20(10): 1218-1249.

2．Northcott, P. A. et al. (2012). “Subgroup-specific structural variation across 1,000 medulloblastoma genomes.” Nature 488: 49–56.

3．Mack, S. C. et al. (2018). “Therapeutic targeting of ependymoma as informed by oncogenic enhancer profiling.” Nature 553: 101–105.

4．Jones, D. T. et al. (2012). “Dissecting the genomic complexity underlying medulloblastoma.” Nature 488: 100–105.

5．Pugh, T. J. et al. (2012). “Medulloblastoma exome sequencing uncovers subtype-specific somatic mutations.” Nature 488: 106–110.

6．Northcott, P. A. et al. (2017). “The whole-genome landscape of medulloblastoma subtypes.” Nature 547: 311–317.

7．Jones, D. T. et al. (2013). “Recurrent somatic alterations of FGFR1 and NTRK2 in pilocytic astrocytoma.” Nat. Genet. 45: 927–932.

8．Mack, S. C. et al. (2014). “Epigenomic alterations define lethal CIMP-positive ependymomas of infancy.” Nature 506: 445–450.

9．Vladoiu, M. C., et al. (2019). “Childhood cerebellar tumours mirror conserved fetal transcriptional programs”. Nature 1.

10．Biankin, A. V. & Maitra, A. (2015). “Subtyping pancreatic cancer.” Cancer Cell 28: 411–413.

11．Peng, J., et al. (2019). “Single-cell RNA-seq highlights intra-tumoral heterogeneity and malignant progression in pancreatic ductal adenocarcinoma.” Cell Res 29(9): 725-738.

12．Pylayeva-Gupta, Y. et al. (2012). “Oncogenic Kras-induced GM-CSF production promotes the development of pancreatic neoplasia.” Cancer Cell 21: 836–847.

13．Von Figura, G. et al. (2014). “The chromatin regulator Brg1 suppresses formation of intraductal papillary mucinous neoplasm and pancreatic ductal adenocarcinoma.” Nat. Cell Biol. 16: 255–267.

14．Habbe, N. et al. (2008). “Spontaneous induction of murine pancreatic intraepithelial neoplasia (mPanIN) by acinar cell targeting of oncogenic Kras in adult mice.” Proc. Natl Acad. Sci. USA 105: 18913–18918.

15．Kopp, J. L. et al. (2012). “Identification of Sox9-dependent acinar-to-ductal reprogramming as the principal mechanism for initiation of pancreatic ductal adenocarcinoma.” Cancer Cell 22: 737–750.

更多信息请关注我们的网站

www.geno-truth.com/singlecell

联系电话：4000-672-118
服务邮箱：service@geno-truth.com

往期内容：

高通量单细胞转录组测序技术的起源

单细胞测序研究癌症之肿瘤微环境研究