国家癌症中心今年1月发布的最新一期全国癌症统计数据显示，恶性肿瘤（癌症）已经成为严重威胁中国人群健康的公共卫生问题之一，占居民全部死因的23.91％。近十几年来，癌症的发病死亡呈持续上升态势。

但是，由于癌症存在个体间甚至个体内的异质性，导致科学界对癌症的认识不足，难以开发更有效的诊疗及预后手段。而单细胞RNA测序技术，允许研究者在单个细胞水平上对肿瘤组织进行分析研究，将极大推动对癌症的认识，帮助开发灵敏度高、准确度高、应用范围广、快速的临床诊疗及预后方法。

为了更为详细的展示单细胞RNA测序技术的“魅力”，我们对多篇使用单细胞RNA测序技术研究不同癌症的文献进行归纳总结，帮助研究者选择合适的研究方式。

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肿瘤是由肿瘤细胞及其周围基质细胞和非细胞组分构成的复合体，肿瘤的发生发展是肿瘤细胞与其微环境相互促进、共同演化的一个动态过程，肿瘤微环境在肿瘤的生长转移过程中发挥至关重要的作用。

肿瘤相关成纤维细胞(Cancer Associated Fibroblasts, CAFs)是肿瘤微环境中最主要的组成成分之一，对肿瘤发生、生长、血管形成、浸润与转移有重要作用（图1）。但是其细胞组成并不明确。

图1 肿瘤相关成纤维细胞CAFs示意图

为了阐明这一问题，Elyada等（2019，Cancer Discovery）利用单细胞RNA测序技术，对来自6名 PDAC（胰腺导管腺癌）患者的肿瘤样本，及其中2名患者的PDAC临近区域正常胰腺组织进行了单细胞水平的转录组分析，并着重分析了肿瘤相关成纤维细胞。

图2 人类PDAC肿瘤样本的细胞组成复杂性

作者应用流式细胞仪将获得的组织单细胞悬液分为成纤维细胞和含有除成纤维细胞外的所有类型细胞两部分，单细胞RNA测序完成后，他们首先将所有检测的肿瘤细胞合并进行聚类分析，展示了人类PDAC肿瘤样本的细胞组成复杂性（图3）。

图3 6名PDAC（胰腺导管腺癌）患者的肿瘤样本的聚类分析结果显示共有15个细胞亚群。其中第2、8和15亚群为I-III型导管细胞。

癌症常表现出显著的个体间/内异质性。为了避免不同个体肿瘤样本中存在的特异性细胞组分对混合样本数据集进行聚类分析时产生干扰，每个患者的单细胞测序数据也进行了聚类分析，结果证实PDAC肿瘤样本的组成细胞不具有患者特异性（图4）。

图4 6名PDAC患者肿瘤样本和2名患者肿瘤临近处正常胰腺样本的单个聚类分析。PDAC肿瘤样本的组成细胞不具有患者特异性。

为了进一步研究各导管细胞的亚群，作者把三个导管细胞亚群的细胞抽取出来进行进一步分析。进一步的聚类结果显示导管细胞亚群内存在更为细微的转录组差异，PDAC中的导管细胞实际上存在4个亚群（图5）。

图5 图3中导管细胞的降维聚类结果。导管细胞亚群内还存在细微的转录组差异。

得益于单细胞RNA测序技术，Elyada等从单细胞水平上揭示出PDAC的CAFs（肿瘤相关成纤维细胞）转录谱异质性，并确认确实存在myCAF和iCAF这两种亚型（图6）。

图6 PDAC患者肿瘤中的CAF存在两个亚群

CAFs在癌症发生发展中起到了重要角色。但是由于传统的bulk测序等技术难以对单个细胞进行分析，因而对CAFs的作用有着相互矛盾的认识。有研究认为CAFs促进肿瘤生长，且“帮助”恶性肿瘤产生耐药性。但近年来有研究发现，CAFs实际上抑制了肿瘤生长。

Elyada等对CAFs的研究发现不仅解决了这一认识矛盾，其研究成果还能够帮助开发更为有效的PDAC诊断、治疗及预后方法。

肿瘤微环境研究——免疫细胞

肿瘤免疫微环境中包含参与机体免疫反应的所有免疫细胞，其中，既有发挥免疫杀伤作用的细胞毒性T淋巴细胞、自然杀伤细胞等，又有发挥免疫抑制作用的骨髓来源的抑制性细调节性T细胞、肿瘤相关巨噬细胞等。

TIL（肿瘤浸润性淋巴细胞）指的是从肿瘤组织中分类出来的淋巴细胞，乳腺癌中TILs的数量是提高患者存活率的可靠预后因子，而T细胞是主要的TIL群。

为了探讨T细胞在肿瘤微环境中是如何发挥作用的，Savas等（2018，Nature Medicine）研究了TNBC（三阴性乳腺癌）肿瘤微环境中的T细胞。

通过对123例乳腺癌患者（84例原发癌，45例转移癌）的TILs中的T细胞进行研究，发现CD45+T细胞在所有原发癌中的比例显著高于转移癌；CD3+ T细胞是三阴性、HER2阳性及荷尔蒙受体阳性（lumina）乳腺癌中主要的TILs群体。 

其中，乳腺癌TME中存在CD3+ T细胞意味着存在一种更强的抗肿瘤的免疫反应，这表明乳腺癌的预后效果较好。

为了找到与预后效果关系更为密切的T细胞亚群，作者从两个原发性TNBC样本中分选出CD3+T细胞，并对分离得到的6,311个CD3+CD45+T细胞的转录组数据进行降维聚类分析，发现了10个T细胞亚群，揭示了CD3+CD45+T细胞在TNBC肿瘤TME中的多样性（图7）。

图7 2名TNBC患者肿瘤样本中CD3+CD45+T细胞的降维聚类结果。揭示了TME中T细胞的异质性

为了检验TNBC的TME存在的T细胞组成在不同患者中是否具有差异，在降维聚类图中根据样本来源进行数据标记。样本1和2中细胞亚群含量的差异反映了TNBC肿瘤样本TME中的T细胞亚群不存在个体间异质性，但不同T细胞亚群的组成比例存在个体间异质性。

图8 根据样本来源，对降维聚类结果进行标识。结果显示不同患者TME中的T细胞亚群组成不存在个体间异质性，但组成比例差异较大。

Savas等发现原发性TNBC的样本中所包含的TILs大多是具有TRM细胞分化特征的CD8+ T细胞，且这种T细胞的免疫检查点分子和效应蛋白质的表达水平很高。对其进行进一步分析后，作者认为CD8+ TRM细胞有助于乳腺癌的免疫监控，且是免疫检查点抑制剂调控的关键靶点，能帮助开发新的免疫疗法。

总结

癌症的异质性是导致癌症研究成果难以应用到临床诊疗的重要原因。由于癌细胞及其肿瘤微环境存在异质性，导致对不同研究对象或同一研究对象不同取样部位的研究得到的结论并不能很好的相互应证，甚至造成对不同部位癌症特性的错误认识。

单细胞RNA测序通过研究单细胞转录组表达的差异，对单细胞RNA测序数据进行降维聚类，从而获得肿瘤组织在个体间以及个体内的异质性；同时对聚类后的某一细胞群进一步研究，如标记基因表达水平、通路相关基因集表达水平等对聚类降维图中的细胞聚群进行标识，有望发现新的细胞亚型，帮助研究者找到诊断治疗癌症的重要标记物。

单细胞RNA测序为研究者提供了一个新的角度去了解并治疗癌症，极大推动癌症诊疗手段的开发与革新！