单细胞测序 | 基因科学新技术助力发现肿瘤治疗新靶点
基因编码就像钢琴琴键上下跳动，奏响生命美好乐章。而某些基因不小心的“失误”，就可能在人体中形成肿瘤，导致生命乐章不和谐，甚至终止。为早日解决肿瘤这一基因病，科学家们利用基因科学寻找药物作用的靶点，继而实现肿瘤个体化治疗。
8月3号绘真医学CEO张惠丹博士通过线上直播与大家分享了“基因科学新技术助力发现肿瘤治疗新靶点”。小编在这里为大家做了简单的梳理，如果想知道具体的内容可通过扫描下方二维码观看回播。
对于上述的研究成果，不得不提这个具有划分时代意义的PCR技术。《纽约时报》这样高度评价：“⾼度创新，⾮常重要，将⽣物学划分为了两个时代：PCR前时代和PCR后时代。”21世纪，第二代和第三代测序技术的相对成熟为研究生物之间的差异和药物靶点的发现奠定了更加雄厚的基础。
我们知道有细胞和基因的存在，那么细胞和基因之间有什么样的空间关系呢？现在大部分的基因检测都是一个平均值的检测，通过把肿瘤组织打碎，然后构建文库，进行基因突变检测。但是这并不足以解释肿瘤组织中真正发生了什么。单细胞测序的出现打破了原先平均值测序的弊端，可以把每一个细胞都研究清楚，使我们对肿瘤的认识无限接近于生物体的本真。
而单细胞测序技术的发展也经历了漫长的探索过程。张博士重点介绍了2015年《Cell》同期发表的两篇基于液滴微流控技术的⾼通量单细胞转录组测序⽂章，这两篇文章使单细胞测序技术的应用得到了迅速发展。下面小编就张博士的讲解对这两篇文章做了简单的描述。
图1 Allon M. Klein, Cell, 2015, 161:1187 图2 Evan Macosko, et al. Cell. 2015. 161:1202 图3是对胚胎干细胞的单细胞转录组的研究，可以看出第七天与第四天相比，细胞分群出现明显差异，在该研究跟踪的时间段里，每天的细胞分群都是不同的。如果将来发现针对胚胎干细胞的相关药物，就需要考虑在哪一天以及针对哪种细胞群进行用药。 图3 Allon M. Klein, Cell, 2015, 161:1187 图4是对视网膜细胞转录组的研究，该研究显示，检测44808个细胞与检测500个细胞相比，细胞群体出现了一个极度增加的现象。然而在药物研发的过程中，药物抵抗型的细胞群体往往是很少的那部分，这就显示了高通量单细胞测序的必要性。 图4 Evan Macosko, et al. Cell. 2015. 161:1202
Weizmann科学研究所的研究团队使用激光捕获显微切割(LCM)技术获取绒毛特定位置处的细胞样本进行RNA-seq，以得到不同位置处的标志基因，结合单细胞测序数据，展示了当肠上⽪细胞沿着绒⽑迁移时，它们发⽣持续分化，在不同位置实现不同功能，打破了以往认为⼀旦肠隐窝处⼲细胞分化成不同类型的细胞就是最终分化的观点。
Lgr5+干细胞的谱系追踪结果 该研究揭示了小肠上皮细胞广泛的空间异质性：绝大多数基因表达具有明显的带状分布模式，几乎没有基因沿绒毛轴向具有一致的表达水平。肠上皮细胞不是终末分化细胞，而是在沿绒毛轴向移动过程中发生连续的转分化。 图5 图5中，左图是肠上皮谱系经典观点示意图，认为只有一种类型的肠上皮细胞，右图是研究者揭示肠上皮细胞沿绒毛轴向移动时，细胞状态发生连续转变。 该研究可⽤于构建身体不同组织的详细细胞图谱，也为研究疾病发⽣发展提供了新的可⽤⼿段。例如，绒⽑顶端细胞似乎负责指挥免疫程序，可能对宿主-微⽣物间相互作⽤有着重要意义；检查⼩肠内壁不符合细胞位置的表达基因可促进了解炎症性肠病机制。
该研究将胰腺癌患者的肿瘤细胞进行分群，然后进行单细胞转录组测序，从图6中可以看出与胰岛管相关的群体是1型导管细胞（Ductal Cell 1）和2型导管细胞（Ductal Cell 2）。 图6 转录组 为了鉴别恶性的细胞，基于平均的表达模式可以计算大规模的染色体拷贝数变异（CNV）。其中2型导管细胞比1型导管细胞和其它细胞具有显著更高的CNV水平。推测2型导管细胞是一个肿瘤细胞群，而1型导管细胞是一个正常细胞群。 图7 CNV 接着，通过功能富集分析显示2型导管细胞中上调的基因主要富集在癌症相关的功能，如细胞增殖、迁移和缺氧，进一步验证了这种亚型的恶性状态。1型导管细胞中上调的基因与正常的胰腺功能相关，包括消化、胰腺分泌和碳酸氢盐运输，表明1型导管细胞仍然具有一定程度的导管细胞的正常功能。 图8 信号通路富集 利用免疫组化染相应的marker也能验证两种导管细胞的存在，也验证了2型导管细胞是胰腺导管腺癌恶性细胞的主要来源。如图9所示： 图9 然后，科研人员又将2型导管细胞进一步分成7个亚群，对每个亚群进行功能富集分析发现每个亚群细胞对应的基因功能是不一样的。如图10所示： 图10 因此，如果所有的胰腺癌患者使用同一种药物，那么该药对于不同患者的疗效是不一样的。但是如果掌握了每个亚群细胞的基因表达，就可以针对每个亚群细胞的基因表达进行靶向药物的研发，那么就可以筛选出相应的胰腺导管癌患者进行靶向药物治疗，实现真正精准治疗的目标。
随着单细胞测序技术的发展，其研究范围不再局限于转录组，而是扩展到了基因组、免疫组、表观组、蛋白组等多组学水平，研究对象涉及染色质、DNA、表观、转录因子、组蛋白、细胞表面蛋白等多种分子信息。
而在肿瘤发生等复杂的生物过程中，异质性同时存在于基因组、转录组、表观组、免疫组等多层面，基因相同的肿瘤细胞可能具有不同的 DNA 甲基化、基因表达、克隆扩增模式，因此常常需要多组学技术才能更加准确地将它们分类为不同亚群，揭示更深层的生物学机制。
为此，张博士介绍了四项联合测序的研究，小编在这里简单梳理了其中的两项:
图11 P1基因组测序 如图11所示：对于P1患者，经过治疗后进行基因组突变测序，原来的A、B、C三个克隆细胞到最后节点的时候已经完全消失了，说明该患者已经没有肿瘤细胞了。 图12 P11基因组测序 如图12所示：而对于P11患者，在中期的时候其肿瘤细胞的突变类型与刚开始的时候是相似的，但在节点的时候，其肿瘤的突变种类发生了巨大的改变。也就是对于这样一个患者，在不同的时间进行治疗，应该选择不同的治疗方法和药物。 图13 P1转录组 通过转录组测序可以看出，对于P1患者，刚开始其基因的表达大多是肿瘤细胞基因的表达，当治疗之后，基本上都是正常细胞。因此，该患者的基因组测序与转录组测序得到了一致性。 图14 P11转录组 而对于P11患者，治疗之后仍然是肿瘤细胞基因的表达，有降解细胞外机制的、低氧相关的等都是肿瘤细胞相关的表达。这与基因组水平的测序也是一致的。
在不同的细胞群中不同的基因表达水平各不相同，且在不同的时间节点上，基因的表达也发生着巨大的改变。 从甲基化学上来讲，从第六天到第十二天，不同的细胞群的甲基化的状态和发展趋势也是不一样的，比如：EPI细胞群呈现持续增加的趋势，TE细胞群的发展趋势是先增加，然后出现平台期，最后再增加，而PE细胞群则是缓慢增加。如图15所示： 图15 以APOA1基因为例，从第六天到第八天，其在每一个细胞群体中的甲基化水平是不一样的，比如对于EPI细胞群，到第八天其细胞呈现出高甲基化。如图16所示： 图16 这项研究对早期胚胎的发育和生殖药物的发现具有非常重要的指导意义。对肿瘤来讲也是，如果肿瘤细胞的甲基化是患者的主要发病因素，就需要知道其甲基化的位点是什么以及发展规律是什么。
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